La Espectroscopia Raman se adapta perfectamente a la microscopia confocal, ya que permite un aumentar el contraste, definición de imágenes y a su vez construir y obtener información tridimensional.

Por medio de este microscopio podemos observar espectros de muestras químicas y biológicas. La invención del microscopio confocal en principio fue para el estudio de eventos biológicos y neurológicos que se producen en vivo, esto fue gracias al científico Marvin Minsky cuyo objetivo principal en su estudio era obtener información de redes neuronales usando preparaciones no coloreadas del tejido cerebral vivo. La ventaja de crear este tipo de técnica es en principio tener un enfoque exacto con una imagen confocal usando un orificio de abertura o agujero del tamaño de un alfiler, permitiendo una definición muy nítida de la imagen de las muestras más gruesas del plano focal del microscopio.

Con el transcurrir de los años y diferentes avances tecnológicos este microscopio fue tomando mucha popularidad, siendo así usado por diferentes científicos de diferentes áreas para estudiar muestras vivas y obtener información tridimensional de las mismas. Hoy en día la usamos para análisis químicos de muestras de materiales y se acopla perfectamente a la espectroscopia debido a su sencilla configuración.

Como acabo de mencionar le espectroscopia Raman se acopla muy bien a el microscopio confocal permitiendo obtener un espectro característico de alguna muestra en especifica en cada pixel de la imagen, este tipo de sistema imagenológico tiene la capacidad de tener una resolución en escala nanométrica de cualquier material.

Podemos obtener información espectral usando diferentes técnicas espectroscópicas como, por ejemplo: absorción, transmisión, reflexión, fotoluminiscencia, emisión, fluorescencia y por supuesto Raman. Sin duda alguna la técnica Raman es la preferida por muchos científicos porque es basada en la dispersión inelástica de la luz monocromática cuando en los fotones su frecuencia cambia al momento de la interacción con el material.

Los fotones de la luz láser son absorbidos por la muestra y reemitidos posteriormente. La frecuencia de los fotones emitidos se desplaza hacia arriba o hacia abajo en comparación con la frecuencia monocromática original, que se conoce como efecto Raman. El cambio Raman proporciona información sobre las energías vibratorias y rotacionales de los enlaces moleculares.

En la actualidad existen diferentes microscopios confocales avanzados que se pueden acoplar a la espectroscopia permitiendo a los usuarios estudiar muestras con superficies rugosas e irregulares, ya que durante el barrido de la muestra se puede obtener un enfoque óptimo en tiempo real a través de un video con luz blanca. Todo esto permitiendo mayor facilidad de maneja a los usuarios, ya que no se necesita un enfoque manual.

Con el transcurrir de los años se pudo observar que la técnica de espectroscopia confocal Raman era la indicada para determinar los niveles de energía y modos vibracionales dentro de una molécula, dicho esto tiene la gran ventaja que con solo excitar una pequeña parte de la molécula cambiando la longitud de onda de excitación, podíamos tener este tipo de información muy exacta. El simple hecho de adaptar a un microscopio un espectrómetro Raman nos proporciona un volumen de muestreo muy controlado, con esto quiero decir que solo necesitamos un filtro espacial para realizar el análisis de la muestra.

Hoy en día se usan diferentes métodos para unos más prácticos, otros no. Sin embargo, la espectroscopia Raman adaptada al microscopio confocal nos brinda la posibilidad de analizar partículas individuales con dimensiones inferiores a 1µm y esto es fabuloso porque ningún otro método tiene esta capacidad. Además de mencionar todo esto no podemos olvidar que para esta técnica no se necesita ningún tipo de preparación para las muestras que se desean analizar, esto permite al usuario un ahorro de tiempo y por supuesto el reutilizar la muestra para análisis posteriores porque las muestra a su vez no se destruyen.

Otro punto importante que deseo acostar acerca de La espectroscopia confocal Raman es que nos muestra espectros con bandas afiladas y muy características en los enlaces moleculares específicos de cada muestra del material analizado, es decir, viene siendo como su huella dactilar.

^{Espectro Raman en escala longitud de ondalicencia Creative Commons Attribution-ShareAlike de Quang-Viet Nguyen}

La intensidad de las bandas en un espectro Raman es proporcional a la concentración de las moléculas correspondientes y, por lo tanto, se puede utilizar para el análisis cuantitativo.

Aunque en el análisis de ciertos tipos de muestras como, por ejemplo, células y tejidos las características espectrales nos dan información sobre ciertos componentes celulares, entonces nos permite especificar muy detalladamente para el análisis cualitativo y así discriminar entre materiales muy parecidos.

Algunos estudios que se han hecho con esta técnica son en muestras biológicas como mencione en la primera parte del post, específicamente en la identificación de células, permitiendo que las bandas resalten y así poder identificar regiones de la membranas de la célula.